大客車不能在高速公路上行駛的時間是凌晨兩點至五點。 根據(jù)《道路旅客運輸企業(yè)安全管理規(guī)范》四十五條規(guī)定，夜間上路行駛的客運車輛必須在凌晨2點至5點之間停在附近的安全區(qū)域。同時，司機應及時提醒車上乘客不要隨意走動。 根據(jù)《道路旅客運輸企業(yè)安全管理規(guī)范》第三十八條 客運企業(yè)在制定運輸計劃時應當嚴格遵守客運駕駛員駕駛時間和休息時間等規(guī)定：1.日間連續(xù)駕駛時間不得超過4小時，夜間連續(xù)駕駛時間不得超過2小時，每次停車休息時間應不少于20分鐘；2.在24小時內(nèi)累計駕駛時間不得超過8小時；3.任意連續(xù)7日內(nèi)累計駕駛時間不得超過44小時，期間有效落地休息；4.禁止在夜間駕駛客運車輛通行達不到安全通行條件的三級及以下山區(qū)公路； 5.長途客運車輛凌晨2時至5時停止運行或?qū)嵭薪玉g運輸；從事線路固定的機場、高鐵快線以及短途駁載且單程運營里程（查成交價|參配|優(yōu)惠政策）在100公里以內(nèi)的客運車輛，在確保安全的前提下，不受凌晨2時至5時通行限制；